Maladie à prions, Creutzfeldt-Jakob et autres maladies neurodégénératives.

Vacuolisation corticale obtenue en microscopie électronique à balayage x3500

Marquage des astrocytes (astrogliose) x100

Résumé

Les maladies neurodégénératives (ou amyloïdoses) qui touchent essentiellement le système nerveux central regroupent entre autres la maladie d’Alzheimer (agent impliqué Aß), la maladie de Parkinson (agent impliqué α-synucléine), la maladie de Huntington (agent impliqué polyQ) et la maladie de Creutzfeldt-Jakob (classiques et variante, agent impliqué Prion). Toutes ces maladies sont caractérisées par un dépôt extracellulaire de substance amyloïde qui n’est plus dégradé par la machinerie cellulaire et s’accumule sous forme de plaques dites amyloïdes. La maladie de Creutzfeldt-Jakob est la seule amyloïdose transmissible. Compte-tenu des données actuelles, on parle non pas de transmissibilité mais d’inductibilité pour les autres protéinopathies. Les autorités de santé ont listé des produits comme inactivants totaux des prions au regard du PSP (activité prionicide). Par principe de précaution et avec des données scientifiques générées de plus en plus conséquentes, nous proposons d’évaluer non seulement des produits prionicides mais également amyloïcides. L’amyloïcidie est définie comme la capacité d’une formulation chimique ou d’un procédé physique à désagréger (défragmenter ou dépolymériser) les plaques amyloïdes formées par les agents impliqués dans les maladies neurodégénératives ; on parle alors d’activité amyloïcide.

1. LES MALADIES A PRIONS

1.1. Généralités : caractéristiques et distribution tissulaire

Les encéphalopathies spongiformes subaigües transmissibles (ESST) ou maladie à prions sont des maladies neurodégénératives qui affectent aussi bien l’homme que l’animal. L’agent infectieux à l’origine de ces maladies, le prion, serait de nature purement protéique. Les ESST ne sont pas des maladies nouvelles. La tremblante du mouton est connue depuis le 18ème siècle et la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ) depuis le siècle dernier. En revanche, l’épizootie d’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) a débuté en 1986 et le passage de l’agent bovin à l’Homme à l’origine de la variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (vMCJ) a été rapporté en 1996. Entre un et deux millions de bovins seraient passés dans la chaîne alimentaire humaine. La variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (vMCJ) a donc été décrite en 1996 en Grande- Bretagne après la constatation de 10 cas atypiques de MCJ chez des sujets de moins de 40 ans, dont neuf étaient âgés de moins de 30 ans (Will et al., 1996). Le premier cas en France a été décelé en avril 1996, chez un jeune lyonnais qui est décédé peu de temps après (Chazot et al., 1996). Hormis leur jeune âge, tous ces malades avaient un tableau clinique atypique à début psychiatrique et une évolution de la maladie anormalement longue (14 mois en moyenne, contre 6 semaines à 6 mois dans les formes habituelles de la MCJ). En particulier, la présence de plaques amyloïdes entourées de vacuoles (plaques florides) est caractéristique dans les coupes histologiques du cerveau (Figure 1).

plaques-amyloide

Figure 1 : Observation d’une coupe de cerveau caractéristique d’un patient atteint de la vMCJ avec la formation de plaques amyloïdes entourées de vacuoles ou plaque floride (Will et al., 1996).

visuels

Figure 2 : Lésions histopathologiques observées chez un patient atteint de la MCJ (Hauw et al., 1998)
: vacuolisation corticale obtenue en microscopie électronique à balayage x 3500.
: marquage des astrocytes (astrogliose) x 100.

Cette variante des MCJ classiques a très vite amené les chercheurs à envisager un lien avec l’épizootie d’ESB. Les premières preuves expérimentales de l’ESB à l’origine du vMCJ chez l’homme ont été établies en 1996. Le macaque inoculé par l’agent de l’ESB présentait les mêmes lésions caractéristiques histopathologiques que celles décrites chez des patients atteints de vMCJ (plaques florides), les mêmes électroencéphalogrammes et la même signature biochimique (Lasmezas et al., 1996 ; Collinge et al., 1996). En 1997, une équipe a confirmé cette hypothèse par l’analyse des profils lésionnels (Bruce et al., 1997). L’agent responsable de l’apparition du vMCJ chez l’homme est bien le même que celui à l’origine de l’ESB. L’hypothèse la plus probable de contamination humaine est la transmission de l’ESB via des tissus bovins hautement infectieux par voie alimentaire. Le nombre de cas de la vMCJ a très vite augmenté dès 1996, surtout au Royaume-Uni.
Après trois années sans aucun nouveau cas, deux nouveaux ont été rapportés en France en juin 2012 et décédés depuis (http://www.cjd.ed.ac.uk/index.html).
Si le risque primaire est maîtrisé en France avec un dépistage systématique de tous les animaux à l’abattoir, on identifie en revanche des risques dans le cadre de la contamination secondaire interhumaine via la transfusion sanguine et via le matériel médico-chirurgical (Gill et al., 2013 ; Chen et al., 2014).

La distribution des agents infectieux prions n’est pas la même entre les formes classiques (essentiellement dans le système nerveux central (SNC)) et la forme variante (SNC et périphérie) d’où ce risque accru dans le cadre de la variante de la maladie.

distribution-tissulaire

Figure 3 : distribution tissulaire des agents prions pour les formes classiques et variantes de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (d’après Wadsworth et al., 2010).

1.2. Nature des agents prions

Les prions sont plutôt des agents hydrophobes. Cette caractéristique leur confère une grande capacité d’adsorption sur des surfaces solides très diversifiées. La contamination de surface est beaucoup plus connue en santé humaine et certains cas iatrogènes de MCJ sont liés à un nettoyage et à une désinfection insuffisants du matériel médical et chirurgical. En effet, une des principales caractéristiques des prions est leur résistance à presque toutes les méthodes classiques d’inactivation. Seuls des traitements drastiques (soude, eau de Javel, autoclavage 134°C) tels que définis par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) sont efficaces, mais présentent la plupart du temps des incompatibilités physique ou chimique avec le matériel. Il devient donc crucial d’un point de vue de santé publique de pouvoir disposer de procédés d’inactivation efficaces compatibles avec le matériel médico-chirurgical à traiter.

1.3. Transmissibilité des agents prions et risque secondaire de contamination interhumaine

Il existe donc bien un risque avéré de transmission secondaire interhumaine de MCJ via le matériel médico-chirurgical à l’hôpital si celui-ci n’a pas subi des procédures spécifiques (Gibbs et al., 1994). En effet, une surface ou un matériel contaminé par l’agent étiologique de ces maladies à prions (PrP) ne peut être traité que selon trois recommandations précises éditées par l’OMS (WHO, 2000) : soit deux procédures chimiques (Javel 20000 ppm au moins 1heure ou soude 1M au moins 1 heure) soit un procédé physique (l’autoclavage à 134°C, 3 bars, 18 minutes). Ces procédures sont drastiques et incompatibles avec les dispositifs médicaux (DM), ceux-ci ne peuvent donc être pour le moment qu’incinéré si un cas de MCJ est révélé sur un patient ayant subi une intervention chirurgicale nécessitant des DM. Les dispositifs mis en place à l’hôpital sont très contraignants et sont régis par des circulaires difficiles à appliquer sur le terrain : initialement, c’est la circulaire n°100 (DGS/DHOS du 11 décembre 1995) qui a modifié les réglementations françaises sur les désinfections et les stérilisations hospitalières ainsi que les recommandations à mettre en oeuvre pour sécuriser les actes de biologie et d’anatomie pathologique, en raison du risque ATNC. Quant à la circulaire de 2001 (n°138 DGS/DHOS du 14 mars 2001), elle prend en compte la notion de la vMCJ avec des précautions plus universelles : il est considéré que chaque individu de la population française jusqu’en 2001, même s’il ne présente aucun risque particulier, a pu être exposé à l’agent de l’ESB. Ainsi, contrairement au risque clairement identifié de l’utilisation d’hormones de croissance extractive contaminée, la population n’est pas identifiée pour le risque vMCJ et le principe de précaution s’applique. En revanche, cette circulaire ne prend pas en compte les nouveaux risques, en particulier au niveau de la transfusion sanguine. Si la population exposée au risque de transfusion sanguine était clairement identifiée, on se retrouverait dans le scénario de l’hormone de croissance avec une population à risque identifiée. Les dispositifs mis en place à l’hôpital lors d’une intervention médico-chirurgicale, sont régis selon le type de patients traités. Les procédures sont donc très contraignantes et difficiles selon le type de patient. Surtout, un risque d’erreur de classement d’un patient suspect n’est pas à exclure suite au questionnaire. La mise en place d’une procédure unique serait une solution pour éviter tout risque. Un document de travail a été initialement soumis au Ministère de la Santé par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des Produits de Santé (ANSM), nommé « Protocol Standard Prion » ou PSP qui renvoie à une instruction publiée au mois de novembre 2011, toujours en vigueur. Compte-tenu de l’évolution des connaissances, une nouvelle version est en cours d’élaboration.

2. LES MALADIES NEURODEGENERATIVES ET LIENS AVEC LES MALADIES A PRIONS

2.1. Généralités : caractéristiques et mécanistique

La MCJ ou maladies à prions (plus de 16000 articles référencés à ce jour) s’inscrit dans le cadre plus général des maladies neurodégénératives du SNC tout comme principalement la maladie d’Alzheimer (plus de 85000 références), la maladie de Parkinson (plus de 70000 références) et la maladie de Huntington (plus de 18000 références). Celles-ci semblent avoir un mécanisme semblable dans la propagation de la maladie par le passage en périphérie puis l’accumulation dans le cerveau de dépôt de protéines mal conformées, dites plaques amyloïdes. On parle alors d’amyloïdoses pour l’ensemble des maladies qui font des dépôts sous forme d’agrégats. On utilise le terme amyloïcide pour décrire l’action d’une formulation chimique ou d’un procédé physique par une dépolymérisation et/ou une défragmentation des agrégats. On parlera de prionicide, terme spécifiquement dédié à l’inactivation des prions mais dont la définition pourra être élargie en fonction de l’évolution des connaissances.
Des équipes ont étudié depuis de nombreuses années plus particulièrement la cinétique de la réaction de conversion de la protéine prion et ont proposé le modèle d’une polymérisation à partir d’un noyau de nucléation.

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Figure 4 : Modèle de conversion par la formation d’un noyau de nucléation (Aguzzi et al., 2004)

Cette théorie postule que la protéine pathologique (PrPSc) et la protéine normale (PrPc) existent en solution dans un équilibre thermodynamique. La PrPc monomérique est un constituant naturel des cellules alors que l’agent infectieux est multimérique, très ordonné en agrégats de PrPSc qui grossissent par recrutement de PrPc monomérique environnante. L’infectiosité augmenterait quand les agrégats de PrPSc deviendraient si gros qu’ils finiraient par se briser en petit noyaux, chacun d’entre eux étant capable de recruter de nouvelles molécules de PrPc et agir comme une unité infectieuse.

Ces caractéristiques des protéines prions peuvent s’élargir aux autres protéines impliquées dans les maladies neurodégénératives. Par exemple, toutes ces protéines s’assemblent pour devenir des agrégats protéiques insolubles qui échappent à la machinerie cellulaire de dégradation des protéines (Renner et al., 2014).

2.2. Modélisation in vitro

Une technique in vitro a alors été développé à partir de cette hypothèse : depuis sa publication initiale en 2001, la PMCA («Protein Misfolding Cyclic Amplification» (Saborio et al., 2001)) est apparue comme une technique incontournable pour amplifier efficacement les prions en tube à essai. Dans son principe, elle amplifie des quantités minimes de protéines prions pathologiques jusqu’à les rendre détectable par des techniques conventionnelles d’immunoblot, en alternant des cycles de sonication et d’incubation dans un substrat contenant la protéine prion normale (voir figure 5).
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Figure 5 : principe général de la PMCA (Moudjou et al., 2010)

Cette technique très largement développée pour les prions a tenté d’être adaptée aux autres protéines sans succès avant que deux publications presque simultanément viennent apporter des résultats très encourageants pour aussi bien pour des fibres d’amyloïdes ß (Aß) que d’alpha synucléine (Herva et al., 2014 ; Salvadores et al., 2014).

Ainsi les protéines peuvent aussi bien se retrouver en périphérie, et donc le risque de souiller des DM lors d’un examen chirurgical invasif ou non, que dans le cerveau. Il existe de nombreux modèles expérimentaux in vitro et in vivo beaucoup plus généralisés pour étudier la MCJ. Seule la MCJ est transmissible dans des conditions « standards » alors que les autres ne le sont que dans un cadre expérimental sur des modèles animaux transgéniques sensibles à l’agent infectieux. Mais les données scientifiques peuvent évoluer.

2.3. Evaluation du risque de transmission inter-humaine des agents impliqués

Une première publication a montré que des dépôts de protéines Alzheimer Aß se retrouvent chez des souris conventionnelles inoculées avec du cerveau humain issu d’un patient Alzheimer (Morales et al., 2011). Un article très récent de l’équipe du Pr. Prusiner (découvreur du prion et prix Nobel) vient de montrer qu’au moyen d’une technique de bioluminescence il est possible de suivre dans un modèle de souris transgéniques une autoproduction de la protéine mutée suite à l’injection de peptides synthétiques ; celle-ci se propage alors dans les deux hémisphères sans aucun autre facteur intervenant n’ait été identifié. Or, c’est justement une des caractéristiques du prion qui n’a pas besoin de cofacteur pour se propager. De nouvelles données qui tendent donc à montrer qu’on se rapproche d’un modèle prion…même si la limite est encore l’utilisation d’animaux transgéniques (Stöhra et al., 2012). Les recherches s’orientent vers un diagnostic ante mortem de détection des agents. Il existe déjà des méthodes appliqués pour la recherche des prions dans les fluides par ‘amplification’ d’un faible signal. Ces techniques tentent d’être adaptées à la recherche de quantités très faibles d’autres agents dans les fluides. Une équipe américaine, la même qui avait décrit pour la première fois une méthode d’amplification pour les prions au début des années 2000, vient d’établir un test avec une spécificité de plus de 90% mais dont le prélèvement de liquide-céphalorachidien à analyser reste très invasif pour le patient (Salvadores et al., 2014).

La maladie de Parkinson affecte plus de 1% de la population âgée de plus de 65 ans. Le marqueur de cette maladie est une protéine de 140 acides aminés, l’alpha synucléine. Celle-ci étant excrétée, il est possible de la détecter dans différents fluides biologiques aussi bien central que périphérique comme le liquide céphalo-rachidien, le plasma, la salive et les cellules mononuclées du sang périphérique (El-Agnaf et al., 2003 ; Devic et al., 2011 ; Prigione et al., 2010). La maladie n’était transmissible qu’à des animaux transgéniques mais une équipe américaine a récemment rapporté que la transmission était dorénavant possible chez des souris conventionnelles (Lee et al., 2012). Cette même équipe vient de publier la notion de souches pour les synucléinopathies (Lee et al., 2013). De même comme on l’a vu auparavant, le développement de technique d’amplification de faibles signaux pour rendre la mesure quantitative a été rapporté très récemment (Herva et al., 2014). Mais peut-on déjà parler d’un prion et donc d’un ATNC pour les agents impliqués dans la maladie de Parkinson ? La réponse est oui pour le Pr Prusiner (Prusiner et al. 2015). Par ailleurs, l’équipe du Dr Collinge vient de montrer que suite au traitement par l’hormone de croissance au Royaume-Uni, chez 50% de ces patients ont été retrouvés des dépôts d’agrégats amyloïdes distincts des agrégats prions (Jaunmuktane et al., 2015). Une étude similaire est en cours chez les patients français traités par l’hormone de croissance : les données préliminaires montrent également la détection de lésions ß amyloïdes sans pathologie Tau associée (Haïk et al., 2016, données non publiées). Enfin, une étude austro-suisse a analysé des patients jeunes décédés de MCJ ayant reçu des greffes de dure-mère. Des dépôts amyloïdes ß ont été détectés chez 70% des patients analysés (Frontzek et al., 2016). Ainsi, compte-tenu de toutes ces données aussi bien la détection en périphérie en plus de la région centrale, et le caractère, pour le moment, d’inductibilité, nous nous proposons par application du principe de précaution de valider des formulations candidates aux propriétés amyloïcides pour inactiver cet agent.

3. PRINCIPE DE PRECAUTION : DEVELOPPEMENT DE FORMULATIONS AMYLOICIDES

Contrairement aux agents prions dont l’inactivation est régie par un protocole standardisé établi par l’ANSM en novembre 2011 (Instruction DGS/RI3/2011/449 du 1er décembre 2011), il n’existe pas de protocole recommandé pour étudier, par exemple, l’alpha-synucléine impliquée dans la maladie de Parkinson. Nous en avons élaboré un à partir des données publiées dans la littérature. Un criblage de formulations candidates à l’inactivation sont en cours d’études dans des modèles in vitro et chez l’animal receveur. Les premiers résultats des travaux in vitro sont déjà disponibles (rapport PCEA 2ème partie) précisant les caractéristiques d’un pouvoir amyloïcide d’un pré-désinfectant pour un dispositif médical.

Ces agents impliqués dans les maladies neurodégénératives formant des plaques amyloïdes ont une grande affinité pour les surfaces et ne concernent pas seulement les dispositifs médicaux. Par exemple, l’industrie pharmaceutique spécialisée exige aussi un haut niveau de qualité et de sécurité mais le risque zéro n’existe pas : des cuves inox (matériel très affin pour les protéines) sont très souvent utilisées pour la production de protéines recombinantes et un mauvais nettoyage entre deux lots de production peut alors contaminer les lots ultérieurs.
Plus généralement, il convient donc de développer des formulations amyloïcides capables de dépolymériser et/ou défragmenter les plaques amyloïdes.

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